Domande frequenti sul kit di isolamento dell'RNA totale animale/cellulare

La seguente analisi dei problemi che potresti incontrare nell'estrazione di RNA di tessuti/cellule animali ti aiuterà con i tuoi esperimenti.Inoltre, per altri problemi sperimentali o tecnici oltre alle istruzioni operative e all'analisi dei problemi, abbiamo un supporto tecnico dedicato per aiutarti.In caso di necessità, contattaci al: 028-83360257 o E-mali : Tech@foregene.com.

L'RNA non viene estratto o le rese di RNA sono basse

Ci sono spesso una varietà di fattori che influenzano l'efficienza del recupero, come ad esempio: contenuto di RNA del campione di tessuto, metodo operativo, volume di eluizione, ecc.

1. Durante il funzionamento è stato eseguito un bagno di ghiaccio o una centrifugazione criogenica (4 °C).

Raccomandazione: Operare a temperatura ambiente (15-25°C) durante tutto il processo, non fare bagni di ghiaccio e centrifugare a basse temperature.

2. Conservazione inadeguata del campione o tempo di conservazione del campione eccessivo.

Raccomandazione: conservare i campioni a -80 °C o congelare in azoto liquido ed evitare l'uso ripetuto di congelamento-scongelamento;provare a utilizzare tessuto fresco o cellule in coltura per l'estrazione dell'RNA.

3. Lisi del campione insufficiente.

Raccomandazione: quando si omogeneizza il tessuto, assicurarsi che il tessuto sia sufficientemente omogeneizzato e che le cellule del tessuto siano sufficientemente divise per spiegare il rilascio di RNA.

4. L'eluente non è stato aggiunto correttamente.

Raccomandazione: confermare che la ddH2O priva di RNasi viene aggiunta goccia a goccia al centro della membrana della colonna di purificazione.

5. Il volume corretto di etanolo assoluto non è stato aggiunto al tampone RL2 o al tampone RW2.

Raccomandazione: seguire le istruzioni, aggiungere il volume corretto di etanolo assoluto al tampone RL2 e al tampone RW2 e mescolare bene prima di utilizzare il kit.

6. Il dosaggio del campione di tessuto non è appropriato.

Raccomandazione: utilizzare 10-20 mg di tessuto o (1-5) × 106 cellule per 500 microlitri di tampone RL1, poiché l'uso eccessivo di tessuto può comportare una ridotta estrazione dell'RNA.

7. Volume di eluizione improprio o eluizione incompleta.

Raccomandazione: il volume di eluizione della colonna di purificazione è 50-200 μl;se l'effetto di eluizione non è soddisfacente, si consiglia di prolungare il tempo di posizionamento a temperatura ambiente dopo l'aggiunta di ddH2O preriscaldata priva di RNasi, ad esempio per 5-10 min.

8.La colonna di purificazione presenta residui di etanolo dopo il lavaggio del tampone RW2.

Raccomandazione: se sono presenti residui di etanolo dopo il lavaggio del tampone RW2, centrifugare la provetta vuota per 1 minuto, il tempo per l'operazione di centrifugazione della provetta vuota può essere aumentato a 2 minuti oppure la colonna di purificazione può essere posta a temperatura ambiente per 5 minuti per rimuovere adeguatamente il residuo etanolo.

L'RNA purificato è degradato

La qualità dell'RNA purificato è correlata a fattori quali la conservazione del campione, la contaminazione da RNasi e la manipolazione, ecc.

1. I campioni di tessuto non vengono conservati in tempo.

Raccomandazione: se i campioni di tessuto o le cellule non vengono utilizzati in modo tempestivo dopo la raccolta, crioconservare immediatamente a -80 gradi centigradi o azoto liquido.Per estrarre l'RNA, utilizzare un campione di tessuto o cellula appena prelevato quando possibile.

2. Ripetuto congelamento-scongelamento dei campioni di tessuto.

Raccomandazione: quando si conservano campioni di tessuto, è meglio tagliarli in piccoli pezzi per la conservazione e rimuovere uno dei pezzi quando li si utilizza per evitare il ripetuto congelamento-scongelamento del campione e la degradazione dell'RNA.

3. L'RNasi viene introdotta o non si indossano guanti monouso, mascherine, ecc. durante l'operazione.

Raccomandazione: gli esperimenti di estrazione dell'RNA vengono eseguiti al meglio in stanze di manipolazione dell'RNA separate e la tabella viene cancellata prima dell'esperimento.

Indossare guanti e maschere monouso durante l'esperimento per ridurre al minimo la degradazione dell'RNA causata dall'introduzione della RNasi.

4. I reagenti sono contaminati da RNasi durante l'uso.

Raccomandazione: sostituire con un nuovo kit di isolamento dell'RNA totale animale per esperimenti correlati.

5. Le provette da centrifuga, i puntali, ecc. utilizzati nella manipolazione dell'RNA sono contaminati da RNasi.

Raccomandazione: confermare che le provette per centrifuga, i puntali, le pipette, ecc. utilizzati nell'estrazione dell'RNA siano tutti privi di RNasi.

L'RNA ottenuto purificato influisce sugli esperimenti a valle

L'RNA purificato dalla colonna di purificazione, se gli ioni sale, il contenuto proteico è troppo grande influenzerà l'esperimento a valle, come ad esempio: trascrizione inversa,Northern Blot et al.

1. L'RNA eluito ha residui di ioni sale.

Raccomandazione: confermare che il volume corretto di etanolo è stato aggiunto al tampone RW2 ed eseguire 2 lavaggi della colonna di purificazione alla velocità centrifuga indicata per il funzionamento;se è presente un residuo di ioni sale, lasciare la colonna di purificazione al tampone RW2 per 5 minuti a temperatura ambiente ed eseguire la centrifugazione per massimizzare la rimozione della contaminazione salina.

2. Residuo di etanolo nell'RNA eluito.

Raccomandazione: confermare che dopo il lavaggio del tampone RW2, eseguire l'operazione di centrifugazione del tubo vuoto alla velocità di centrifugazione indicata per il funzionamento, aumentare il tempo dell'operazione di centrifugazione del tubo vuoto a 2 minuti se sono ancora presenti residui di etanolo o lasciarlo a temperatura ambiente per 5 min dopo la centrifugazione del tubo vuoto per massimizzare la rimozione dei residui di etanolo.