Preparazione e precauzioni dell'estrazione del RNA

Sterilizzazione delle punte della pipetta e tubi del PE, ecc.

1. Prepari 0,1% (un millesimo) DEPC (sostanza altamente tossica) con acqua deionizzata, utilizzilo con attenzione in un cappuccio del vapore ed immagazzinilo a 4°C a partire da luce;

L'acqua di DEPC è l'acqua pura trattata con DEPC e sterilizzata con temperatura elevata ed alta pressione. Provato per essere esente da RNAsi, dalla dnasi e dalla proteinasi.

2. Metta la punta della pipetta ed il tubo del PE in 0,1% DEPC ed assicuri che la punta della pipetta ed il tubo del PE siano riempiti di 0,1% reparti.

3. Protegga da leggero, lasci il supporto, durante la notte (12-24h)

4. La scatola che contiene la punta ed il tubo del PE non deve essere inzuppata in DEPC. Dopo approssimativamente l'eliminazione dell'acqua di DEPC in punta o tubo del PE, imballilo su ed avvolgalo su.

5. 121 grado di Celsius, 30min

6. 180 gradi di Celsius, si asciugano per parecchie ore (almeno 3 ore)

Nota: a. guanti e maschere del lattice di usura quando trattano DEPC! b, o senza sterilizzazione di DEPC, 130 ℃, 90min autoclave (sterilizzazione ad alta temperatura di molti laboratori due volte)

Considerazioni dell'estrazione del RNA

Due fenomeni importanti di guasto di isolamento del RNA del tessuto

La degradazione del RNA ed i residui di impurità in tessuti, per quanto riguarda degradazione, ci hanno lasciati in primo luogo esaminare perché il RNA ha estratto dalle cellule di cultura facilmente non è degradato. I reagenti esistenti tutti dell'estrazione del RNA contengono le componenti che rapidamente inibiscono la RNAsi. Aggiunga il lysate alle cellule di cultura e semplicemente mescolilo, tutte le cellule possono essere mescolate completamente con il lysate e le cellule completamente sono fatte l'elettrolisi. Dopo che le cellule sono fatte l'elettrolisi, i principi attivi nel lysate immediatamente inibiscono la RNAsi intracellulare, in modo dal RNA rimane intatto. Cioè, perché le cellule di cultura facilmente e completamente sono contattate con il lysate, il loro RNA non è degradato facilmente; d'altra parte, il RNA nel tessuto è degradato facilmente perché le cellule nel tessuto non sono facili da contattare rapidamente il lysate. dovuto il contatto sufficiente. Così, presupporre là è un modo trasformare il tessuto in un unicellulare mentre l'attività d'inibizione del RNA, il problema di degradazione potrebbe completamente essere risolta.

La fresatura dell'azoto liquido è il più efficace tale metodo. Tuttavia, il metodo di fresatura dell'azoto liquido è molto importuno, particolarmente quando il numero dei campioni è grande. Ciò ha provocato la migliore cosa seguente: l'omogeneizzatore. Il metodo dell'omogeneizzatore non considera la domanda di come l'attività della RNAsi è inibita prima che le cellule siano contattate con il lysate, ma piuttosto prega che il tasso di rottura del tessuto è più veloce del tasso a cui la RNAsi intracellulare degrada la Marina militare.

L'effetto dell'omogeneizzatore elettrico è migliore e l'effetto dell'omogeneizzatore di vetro è povero, ma in generale, il metodo dell'omogeneizzatore non può impedire il fenomeno di degradazione. Di conseguenza, se l'estrazione è degradata, l'omogeneizzatore elettrico originale dovrebbe essere usato per la molatura con l'azoto liquido; l'omogeneizzatore di vetro originale dovrebbe essere cambiato ad un omogeneizzatore elettrico o direttamente essere macinato con azoto liquido. Il problema è quasi 100% fattibile. ottenga risolto.

Il problema del residuo dell'impurità che colpisce gli esperimenti successivi ha cause più diverse che la degradazione e le soluzioni sono corrispondentemente differenti. In conclusione, se ci sono degradazione o impurità residue nel tessuto, il metodo/reagente dell'estrazione per il materiale sperimentale specifico deve essere ottimizzato. Non dovete usare i vostri campioni preziosi per l'ottimizzazione: potete comprare alcuni piccoli animali come il pesce/pollo dal mercato, prendere la parte corrispondente del materiale per l'estrazione del RNA e l'altra parte per l'estrazione della proteina - frantumazione con la bocca, lo stomaco e l'estratto degli intestini.

Il RNA dell'obiettivo del RNA estratto è usato per differente continua gli esperimenti ed i suoi requisiti di qualità sono differenti

la costruzione della biblioteca del cDNA richiede l'integrità del RNA senza residui di inibitori di reazione enzimica; Nordico richiede il più alta integrità del RNA ed abbassano i requisiti dei residui degli inibitori di reazione enzimica; RT-PCR non richiede l'integrità troppo alta del RNA, ma inibisce le reazioni enzimiche. I requisiti del residuo sono rigorosi. L'input determina l'uscita; ogni volta che lo scopo è di ottenere il RNA di elevata purezza, costerà la gente ed i soldi.

Raccolta/stoccaggio dei campioni

I fattori che colpiscono la degradazione dopo che il campione lascia al body/or vivente l'ambiente originale della crescita, gli enzimi endogeni nel campione cominceranno a degradare il RNA ed il tasso di degradazione è collegato con il contenuto degli enzimi endogeni e della temperatura. Tradizionalmente, ci sono soltanto due modi completamente inibire l'attività enzimatica endogena: aggiunga immediatamente il lysate ed omogeneizzi completamente e rapidamente; i piccoli pezzi incisi ed immediatamente si congelano in azoto liquido. Entrambi gli approcci richiedono l'operazione veloce. L'ultimo è adatto a tutti i campioni, mentre il precedente è soltanto adatto a tessuti con il contenuto basso delle cellule e degli enzimi endogeni e più facile da omogeneizzare. Specificamente, tessuto vegetale, fegato, timo, pancreas, milza, cervello, grasso, tessuto del muscolo, ecc. sono congelati il più bene con azoto liquido prima del procedimento.

Frammentazione ed omogeneizzazione dei campioni

I fattori che colpiscono la frammentazione del campione del rendimento e di degradazione è per omogeneizzazione accurata, che è per il rilascio completo e completo di RNA. Le cellule possono direttamente essere omogeneizzate senza essere rotta. I tessuti possono essere omogeneizzati solo dopo essere rotta. Il lievito ed i batteri devono essere rotti con gli enzimi corrispondenti prima che possano essere omogeneizzati. I tessuti con il contenuto endogeno più basso degli enzimi e l'omogeneizzazione più facile possono essere schiacciati ed omogeneizzati contemporaneamente nel lysate da un omogeneizzatore; tessuto vegetale, fegato, timo, pancreas, milza, cervello, grasso, tessuto del muscolo ed altri campioni, sono neanche alti in enzimi endogeni o facilmente non sono omogeneizzati, in modo dalla rottura e l'omogeneizzazione del tessuto devono essere realizzate esclusivamente. Il metodo più affidabile e più produttivo di frammentazione sta macinando con l'azoto liquido ed il metodo attendibile di omogeneizzazione è l'uso di un omogeneizzatore elettrico. Una nota speciale circa fresatura con l'azoto liquido: il campione non deve essere sciolto durante l'intero processo di macinazione, poichè gli enzimi endogeni sono più probabili funzionare una volta congelati.

Scelta di lysate

Colpendo la convenienza dell'operazione ed i fattori delle impurità endogene residue le soluzioni comunemente usate di lisi possono quasi inibire l'attività di RNAsi. Di conseguenza, il punto chiave di scelta della soluzione di lisi è di considerare congiuntamente al metodo di purificazione. C'fa un'eccezione: i campioni con il contenuto endogeno elevato degli enzimi sono raccomandati per usare un lysate che contiene il fenolo per aumentare la capacità di inattivare gli enzimi endogeni.

Scelta del metodo di purificazione

I fattori che colpiscono le impurità endogene residue, la velocità dell'estrazione per i campioni puliti quali le cellule, risultati soddisfacenti possono essere ottenuti con quasi tutto il metodo di purificazione attuale. Ma per molti altri campioni, particolarmente quelli con gli alti livelli delle impurità quali le piante, fegato, batteri, ecc., scegliere un metodo adatto di purificazione è cruciale. Il metodo centrifugo di purificazione della colonna ha una velocità veloce dell'estrazione e può efficacemente rimuovere le impurità che colpiscono la reazione enzimatica successiva di RNA, ma è costosa (Foregene può offrire i corredi redditizi, più dettagli clicca qui); usando i metodi economici e classici di purificazione, quale la precipitazione del LiCCl, può anche ottenere i risultati soddisfacenti, ma il tempo dell'operazione è lungo.

«Tre discipline ed otto attenzioni» per l'estrazione del RNA

Disciplina 1: Metta un termine alla contaminazione degli enzimi esogeni.

Nota 1: Indossi rigorosamente le maschere ed i guanti.

Nota 2: I tubi centrifughi, le teste di punta, i coni retinici della pipetta, i carri armati dell'elettroforesi ed i banchi sperimentali in questione nell'esperimento dovrebbero essere eliminati completamente.

Nota 3: I reagenti/soluzioni in questione nell'esperimento, particolarmente l'acqua, devono essere senza RNAsi.

Disciplina 2: Blocchi l'attività degli enzimi endogeni

Nota 4: Scelga un metodo appropriato di omogeneizzazione.

Nota 5: Scelga un lysate appropriato.

Nota 6: Regoli il livello iniziante del campione.

Disciplina 3: Chiarisca il vostro scopo dell'estrazione

Nota 7: Con tutto il sistema del lysate che si avvicina alla quantità cominciante massima di campione, l'indice di successo dell'estrazione cade acutamente.

Nota 8: Il solo criterio economico per la riuscita estrazione del RNA è un successo negli esperimenti successivi, non rendimento.

10 fonti principali di contaminazione della RNAsi

1. Le dita sono la prima fonte di enzimi esogeni, in modo dai guanti devono essere indossati frequentemente e sostituiti. Inoltre, le maschere devono anche essere indossate, perché respirare è inoltre una fonte importante di enzimi. Un assegno complementare di uso della maschera del guanto è di proteggere lo sperimentatore.

2. Le punte della pipetta, tubi centrifughi, pipetta – la RNAsi non può essere inattivata dalla sterilizzazione da solo, in modo dalle punte della pipetta ed i tubi centrifughi dovrebbero essere trattati con DEPC, anche se sono segnate come DEPC ha trattato. È meglio da utilizzare una pipetta per un fine particolare, la pulisce con una palla di cotone dell'alcool di 75% prima dell'uso, particolarmente la barretta; inoltre, essere sicuro di non usare un dispositivo di rimozione capo.

3. L'acqua/amplificatore deve essere esenti da contaminazione della RNAsi.

4. Almeno la tavola della prova dovrebbe essere asciugata con le palle di cotone dell'alcool di 75%.

• La RNAsi che endogena tutti i tessuti contengono gli enzimi endogeni, surgelamento così dei tessuti con azoto liquido è il migliore modo ridurre la degradazione. Lo stoccaggio dell'azoto liquido/metodo stridente è effettivamente inopportuni, ma è il solo modo per i tessuti con gli alti livelli degli enzimi endogeni.

6. Il RNA prova i prodotti dell'estrazione del RNA può contenere le tracce di contaminazione della RNAsi.

7. L'estrazione del plasmide dell'estrazione del plasmide usa spesso la RNAsi per degradare il RNA e la RNAsi residua dovrebbe digerirsi con proteinasi K ed essere estratta dal PCI.

8. Lo stoccaggio anche se è memorizzato alla bassa temperatura, tracce del RNA di RNAsi causerà la degradazione del RNA. La migliore soluzione per conservazione a lungo termine di RNA è una sospensione alcool/del sale, perché l'alcool inibisce tutta l'attività enzimatica alle basse temperature.

9. Quando i cationi (Ca, mg) contengono questi ioni, riscaldare a 80C per 5 minuti indurrà il RNA ad essere fenduto, in modo da se il RNA deve essere riscaldato, la soluzione di conservazione deve contenere un agente chelante (citrato di sodio di 1mM, pH 6,4).

10. Gli enzimi utilizzati negli esperimenti successivi possono essere contaminati da RNAsi.

10 punte per l'estrazione del RNA

1: Rapidamente impedire attività della RNAsi. I campioni sono congelati rapidamente dopo la raccolta e la RNAsi è inattivata tramite l'operazione rapida durante la lisi.

2: Scelga un metodo appropriato dell'estrazione per il tessuto con il contenuto elevato del ribozima ed il tessuto adiposo è la cosa migliore da usare il metodo che contiene il fenolo.

3: La qualità di previsione richiede nordico, la costruzione della biblioteca del cDNA richiede ad alta integrazione e RT-PCR e l'RPA (analisi di protezione della ribonucleasi) non richiedono ad alta integrazione. RT-PCR richiede l'elevata purezza (residui dell'inibitore di enzimi).

4: L'omogeneizzazione accurata è la chiave al miglioramento del rendimento ed a ridurre la degradazione.

5: Controlli l'integrità di rilevazione dell'elettroforesi del RNA, 28S: 18S = 2: 1 è un segno completo, 1: 1 è inoltre accettabile per la maggior parte dei esperimenti.

6: Rimozione di DNA per RT-PCR, l'analisi di matrice è meglio da usare la dnasi I per eliminare il DNA.

7: Riduca la contaminazione degli enzimi esogeni - gli enzimi non possono essere importati dall'esterno.

8: Nel concentrare l'acido nucleico di basso concentrazione, un reagente della co-precipitazione dovrebbe aggiungersi. Ma per impedire il co-precipitante che contiene gli enzimi e contaminazione del DNA.

9: Dissolva completamente il RNA se necessario, il calore a 65C per 5 minuti.

metodo adatto di stoccaggio

Può essere immagazzinato – 20C per un breve periodo ed a – a 80C a lungo. Il primo punto nel miglioramento dei rendimenti del RNA è di rend contoere che il contenuto del RNA dei campioni differenti varia notevolmente. Alta abbondanza (2-4ug/mg) quale fegato, pancreas, cuore, abbondanza media (0.05-2ug/mg) quale il cervello, embrione, rene, polmone, timo, ovaia, abbondanza bassa (<0>

1: Faccia l'elettrolisi le cellule per liberare la Marina militare – se il RNA non è liberato, il rendimento sarà ridotto. Gli impianti elettrici di omogeneizzazione migliori di altri metodi di omogeneizzazione, ma possono anche avere bisogno di di combinarsi con altri metodi, quale azoto liquido che schiaccia, digestione enzimatica (lisozima/Lyticase)

2: Ottimizzazione del metodo dell'estrazione. I più grandi problemi con ai i metodi basati a fenolo sono la stratificazione incompleta e perdita parziale del RNA (il surnatante non può completamente essere rimosso). La stratificazione incompleta è dovuto il contenuto proteico elevato e dell'acido nucleico, che può essere risolto aumentando la quantità di lysate usata o riducendo la quantità di campione. Un punto dell'estrazione di cloroformio si è aggiunto al tessuto adiposo. La perdita del RNA può essere ridotta retro-pompando o rimuovendo lo strato organico seguito da centrifugazione. Il più grande problema con ai i metodi basati a centrifugazione della colonna è campione in eccesso.

Punte classiche dell'estrazione

1. Purificazione del fenolo: Aggiunga vigoroso un volume uguale di fenolo/cloroformio e di miscela di 1:1 per 1-2 minuti. Centrifuga all'alta velocità per 2 minuti. Rimuova con attenzione il surnatante (80-90%). Non ottenga mai allo strato medio. Un volume uguale della soluzione della reazione può aggiungersi al fenolo/al cloroformio ed il surnatante ha rimosso. I due surnatanti possono essere mescolati insieme affinchè la precipitazione acida nucleica migliorino il rendimento. Non sia troppo delicato quando si mescolano e non provi a rimuovere tutto il surnatante.

2. Lavaggio con l'etanolo 70-80%: Durante il lavaggio, l'acido nucleico deve essere sospeso per assicurarsi che il sale residuo sia lavato via. Allo stesso tempo, subito dopo del versamento fuori dall'etanolo, la centrifuga all'alta velocità per alcuni secondi e poi elimina l'etanolo residuo con una pipetta. Dissolva dopo essere stato alla temperatura ambiente per 5-10 minuti.

11. Estrazione delle organizzazioni speciali

1. Tessuto fibroso: La chiave all'estrazione del RNA dal tessuto fibroso quali cuore/muscolo scheletrico è completamente di interrompere il tessuto. Questi tessuti hanno densità bassa delle cellule, in modo dalla quantità di RNA per peso specifico del tessuto è bassa ed è meglio da usare come molto importo cominciante come possibile. Sia sicuro di frantumare completamente il tessuto nelle circostanze di congelamento.

2. Tessuti con ad alta percentuale proteica/contenuto di grassi: il cervello/contenuto di grassi di verdure è alti. Dopo l'estrazione del PCI, il surnatante contiene i flocculi bianchi. Il surnatante deve essere riestratto con cloroformio.

3. Tessuti con il contenuto elevato ribozima/dell'acido nucleico: la milza/timo ha contenuto elevato del ribozima e dell'acido nucleico. Il tessuto stridente nelle circostanze di congelamento seguite da omogeneizzazione rapida può efficacemente inattivare i ribozimi. Tuttavia, se il lysate è troppo viscoso (dovuto il contenuto in acido nucleico elevato), l'estrazione del PCI non potrà stratificare efficacemente; l'aggiunta del più lysate può risolvere questo problema. Le estrazioni multiple del PCI possono eliminare il DNA più residuo. Se le forme bianche di un precipitato subito dopo di aggiunta di alcole, indica la contaminazione del DNA. Riestrazione con il PCI acido dopo che la dissoluzione può rimuovere la contaminazione del DNA.

4. Tessuto vegetale: Il tessuto vegetale è più complesso del tessuto animale. Generalmente, le piante sono frantumate negli stati dell'azoto liquido, così degradazione del RNA dagli enzimi endogeni è rare. Se il problema di degradazione non è risolto, quasi certamente è causato dalle impurità contenute nel campione. Le impurità hanno contenuto in molte piante condurranno ai residui e la ragione per i residui è spesso perché queste impurità hanno alcune similarità con RNA: precipitate e precipito ed adsorbite ed adsorbo. Queste caratteristiche determinano che sono inibitori di enzimi molto forti.

Attualmente, i reagenti commerciali dell'estrazione del RNA possono adattarsi a quasi tutti i tessuti animali con i piccoli adeguamenti, ma ci sono pochi reagenti commerciali dell'estrazione del RNA che possono essere adatti alla maggior parte dei tessuti vegetali. Fortunatamente, Foregene può fornire i corredi speciali dell'estrazione del RNA della pianta, noi ha corredo totale di isolamento del RNA della pianta, più totale del corredo di isolamento del RNA della pianta. L'ultimo è progettato specialmente per le piante con il contenuto elevato del polifenolo e del polisaccaride. Per l'estrazione del RNA, le risposte dagli utenti del laboratorio sono particolarmente buone.

12. L'effetto del campione che congela e che scioglie il campione congelato può essere più grande e deve essere tagliato prima di essere usando per l'estrazione del RNA. I campioni tendono a fondersi (possibilmente parzialmente) durante il taglio. I campioni congelati possono avere bisogno di di essere pesato prima dell'estrazione del RNA e lo scongelamento definitivamente si presenterà durante questo processo. A volte, lo scongelamento del campione inoltre si presenta durante il processo di fresatura dell'azoto liquido; o il campione congelato direttamente si aggiunge al lysate senza fresatura dell'azoto liquido e lo scongelamento definitivamente si presenterà prima dell'omogeneizzazione completa. Gli esperimenti hanno indicato che il tessuto congelato è a degradazione più incline del RNA durante lo scioglimento che il tessuto fresco. La ragione probabile: Il processo di gelata-disgelo interrompe le strutture all'interno della cellula, rendente la più facile affinchè gli enzimi endogeni entr inare contatto diretto con il RNA.

13. Il giudizio di qualità del RNA solitamente, l'elettroforesi è usato per giudicare l'integrità di RNA e A260/A280 è usato per giudicare la purezza di RNA. Nella teoria, il RNA intatto ha un rapporto di 28S: 18S = il 2.7:1 e la maggior parte dei dati sottolineano il rapporto di 28S: 18S = 2: 1. Il fatto è che quasi nessuno del RNA estratto dai campioni all'infuori delle cellule è in un rapporto di 2:1 (questo è stato ottenuto facendo uso del Agilent Bioanalyzer).

I risultati dell'elettroforesi di RNA sono colpiti da molti fattori, compreso la struttura secondaria, gli stati dell'elettroforesi, il carico del campione, il grado di saturazione dall'eb, ecc. Usi l'elettroforesi indigena per individuare il RNA ed usare l'indicatore del DNA come controllo. Se i 28S a 2kb e al 18S a 0.9kb sono chiari e 28S: 18S > 1, l'integrità può soddisfare le richieste della maggior parte dei esperimenti successivi.

A260/A280 è un indicatore che ha causato molta confusione. In primo luogo, è necessario da chiarire il significato originale di questo indicatore per gli acidi nucleici: RNA puro, suo A260/280 = circa 2,0. Il RNA puro è i because e A260/A280 = 2 è “l'effetto”. Ora ognuno sta usando A260/A280 come because, pensante quello «se A260/A280 = 2, quindi il RNA è puro», che conduce naturalmente a confusione.

Se siete interessato, potete aggiungere un piccolo reagente che è usato spesso nell'estrazione, quali il fenolo, l'isotiocianato della guanidina, il PIOLO, ecc., al vostro campione del RNA e poi misura il rapporto A260/A280. La realtà è che molti dei reagenti utilizzati per l'estrazione del RNA come pure molte impurità nel campione, assorbono intorno a A260 e a A280, colpire A260/A280.

L'approccio più istruttivo attualmente è di esplorare i campioni del RNA nella gamma di 200-300 nanometro. La curva di RNA puro ha le seguenti caratteristiche: la curva è liscia, A230 e A260 sono due punti di flessione, A300 sono vicini a 0, a A260/A280 = intorno 2,0 e a A260/A230 = intorno 2,0. Se i dati di ricerca non sono disponibili, il rapporto A260/A230 deve anche essere risoluto, poichè questo rapporto è più sensibile a residuo di tutte le impurità che colpiscono la reazione enzimatica. Consideri il cammino lineare del dispositivo (0.1-0.5 per A260).

Ci sono altri due fenomeni utili: il rapporto sarà circa 0,3 più basso quando A260/A280 è misurato in acqua; mentre il rapporto ha misurato in ED da 10 millimetri è circa 0,2 superiore a quello misurato in ED da 1 millimetro.