RT-QPCR EasyTM Taqman una miscela matrice in tempo reale di punto RT-PCR

RT-qPCR EasyTM (un punto) - Taqman

Per la PCR in tempo reale facendo uso di cDNA, ha purificato il DNA

Introduzione di prodotto

I prodotti facili una tappa di serie di Foregene RT-PCR realizzano che la reazione integrata da RNA al DNA a doppia elica, cioè, invertire la trascrizione e l'amplificazione di PCR sono completate nello stesso tubo centrifugo della reazione e nello stesso sistema di reazione, così i punti sperimentali semplificati, il piano sperimentale hanno ottimizzato e l'efficienza sperimentale è migliorato.

RT-qPCR EasyTM (un punto) - Taqman facendo uso della DNA polimerasi di Foregene HotStar Taq, il sistema ottimizzato del qPCR di Taqman può rapidamente e specificamente realizzare rilevazione quantitativa in tempo reale RT-qPCR dei modelli del RNA della traccia.

Trasporto e condizioni di stoccaggio

• Condizioni di trasporto: L'intero processo è trasportato in un contenitore di ghiaccio a bassa temperatura per assicurare che il corredo sia in uno stato di <4>
• Condizioni di stoccaggio: Il corredo è immagazzinato a -20℃. Immagazzini il prodotto in un frigorifero della temperatura costante a -20℃ subito dopo della ricevuta. Se le condizioni di stoccaggio sono appropriate, il prodotto non degraderà alcuna prestazione durante il periodo di un anno di validità.

Informazioni componenti del corredo

• Miscela-Taqman di 2× RT-qPCR EasyTM: Trascrittasi inversa di Foregene, inibitore della RNAsi, DNA polimerasi di Foregene HotStar Taq, rapporto ottimizzato dei dNTPs, Mg2+, stabilizzatore, rinforzatore ed ottimizzatore.
• Tintura di riferimento di ROX: Usato generalmente sui cyclers termici in tempo reale di PCR delle società quali ABI, Stratagene, ecc., per regolare la differenza fra i tubi di PCR causati dagli errori di caricamento del campione di PCR. La concentrazione di tintura di riferimento di ROX richiesta dagli strumenti differenti è differente e l'utente può aggiungerlo secondo la concentrazione raccomandata dello strumento.

Precauzioni:

i reagenti di u dovrebbero evitare il congelamento ripetuto e lo scioglimento, altrimenti la prestazione dei reagenti diminuirà o diventerà invalida.

la u i reagenti nel corredo dovrebbe essere protetta da luce ed essere immagazzinata a -20°C.

u è raccomandato per usare l'estrazione del campione o il RNA fresca del modello immagazzinato a -80°C (RNA dovrebbe evitare il congelamento ripetuto e lo scioglimento).

la u per evitare la contaminazione della RNAsi, esegue prego l'esperimento nello spazio senza RNAsi; le punte della pipetta ed i tubi di PCR utilizzati devono essere senza RNAsi; ed indossi i guanti eliminabili e le maschere.

la u questo corredo deve essere usata con gli iniettori specifici per gli esperimenti. Selezioni prego gli iniettori specifici affinchè il gene siano amplificati secondo i bisogni dell'esperimento.

la u prima dell'uso, ha messo la miscela-Taqman di 2× RT-qPCR EasyTM su ghiaccio completamente alla colata, al colpo di frusta ed alla miscela molto prima di uso; la preparazione del sistema dovrebbe essere azionata su un bagno di ghiaccio per migliorare la prestazione del corredo e per aumentare l'amplificazione di PCR.

Concentrazione nel RNA del modello

RT-qPCR EasyTM (un punto) - Taqman: (1 RNA di totale di NG pg-100 sistema)/20 μl.

Guida di operazione

: Preparazione dei materiali e dei reagenti

• Prepari il modello pronto del RNA (è raccomandato per usare i corredi di serie del corredo di isolamento del RNA di totale di Foregene per estrarre e purificare il RNA), iniettori specifici (μM 10) e materiali di consumo e strumenti riferiti.

Nota: Assicuri prego l'integrità di RNA e provi ad usare il RNA estratto dai campioni freschi.

• Miscela-Taqman messa di 2× RT-qPCR EasyTM, tintura senza RNAsi di riferimento di 20× e di ddH2O ROX (se necessario) su ghiaccio per lasciarlo fondersi naturalmente e passare rapidamente la parete del tubo per mescolarsi fino ad uso.

B: Preparazione del sistema RT-qPCR

La miscela-Taqman di 2× il RT-qPCR EasyTM è conveniente e rapida da usare ed evita l'inquinamento durante il funzionamento e gli errori sperimentali causati tramite le preparazioni multiple del sistema di reazione nella massima misura possibile. Nel usando, soltanto la metà del volume del sistema di reazione (per esempio, se il sistema di reazione è μl 20, prenda 10 la soluzione della miscela-Taqman del μl 2× il RT-qPCR EasyTM), aggiunge la quantità appropriata di modello del RNA e di iniettori specifici ed aggiunge ddH2O senza RNAsi per comporre il volume. La preparazione specifica del sistema di reazione RT-qPCR può riferirsi a per presentare 1 qui sotto.

Tabella 1: Preparazione del sistema RT-qPCR

Nota: L'iniettore di andata e l'iniettore inverso sono iniettori specifici per il gene dell'obiettivo. Il sistema del qPCR può essere regolato secondo i bisogni sperimentali ed il modello di PCR. Per la concentrazione finale di maggior parte di iniettori, raccomandiamo 400nM. Regoli prego il dosaggio dell'iniettore e della sonda specifici secondo la concentrazione pronta secondo la nostra concentrazione finale raccomandata. Per qPCR con il sistema 50μl, riferisca prego al sistema 20μl per regolare proporzionalmente la quantità di reagenti.

1*: Scelga la concentrazione finale appropriata di tintura di riferimento di ROX secondo gli strumenti quantitativi differenti di PCR. La concentrazione ottimale di tintura di riferimento di ROX per le macchine quantitative comuni di PCR è indicata nella seguente tavola:

C: Regolazione del sistema di reazione RT-qPCR

• Dopo la preparazione del sistema RT-qPCR in riferimento alla tavola di cui sopra, miscela delicatamente (potete usare delicatamente una punta della pipetta alla pipetta; potete anche mescolarti su un vortexer e su una centrifuga brevemente per raccogliere il liquido sparso sulla parete del tubo o sul cappuccio del tubo e su un posto sul contenitore di ghiaccio per uso successivo).
• Riferisca alle regolazioni di programma della reazione RT-qPCR (tabella 2) per fissare la temperatura ed il tempo della reazione.

Nota: Per assicurare l'attività della miscela-Taqman di 2× il RT-qPCR EasyTM e per migliorare la sua efficienza di amplificazione, è meglio da preparare il sistema di reazione RT-qPCR dopo l'installazione del programma dello strumento di PCR, di modo che il programma della reazione può essere seguito subito dopo che la preparazione del sistema è completata.

• Per ottenere il migliore effetto del qPCR, la PCR di pendenza può essere usata per ottimizzare i termini della reazione per i modelli differenti e gli iniettori differenti.

Nota: La gamma di temperature di estensione della DNA polimerasi di Foregene Hotstar Taq ha fornito in questo corredo è: 60-72℃ e la migliore temperatura di estensione è 72℃.

Seguire è un esempio degli stati della reazione RT-qPCR. È raccomandato per usare un metodo in due tappe per la reazione di PCR. Quando la concentrazione nel modello è troppo bassa per causare l'amplificazione non specifica, il valore basso del TM dell'iniettore conduce ad efficienza bassa di amplificazione o ripetibilità difficile della curva di amplificazione, ecc., è raccomandato per provare il metodo in tre tappe per la reazione di PCR. Riferisca alla tabella 2-1 (metodo in due tappe) ed alla tabella 2-2 (metodo in tre tappe) per la regolazione degli stati della reazione RT-qPCR.

Tabella 2-1: Regolazione di programma di reazione RT-qPCR (metodo in due tappe)

Tabella 2-2: Regolazione di programma di reazione RT-qPCR (metodo in tre tappe)

1*: Il tempo inverso della trascrizione può essere regolato secondo i bisogni sperimentali. I geni endogeni generali quale β-actina hanno bisogno soltanto di 10 minuti; per individuare i geni espressi specifici, il tempo inverso della trascrizione può essere giustamente esteso come stato necessario.

2*: Fissi un momento specifico secondo la lunghezza del frammento amplificato dell'obiettivo. La velocità di amplificazione della DNA polimerasi di Foregene HotStar Taq è 2kb/min

Nota: Gli stati della reazione di PCR variano secondo i termini strutturali del modello, degli iniettori, ecc. Per i modelli del RNA con le strutture secondarie complesse, è raccomandato per usare 42℃ per il primo punto di trascrizione inversa. Nell'operazione specifica, è necessario da progettare gli stati ottimali della reazione secondo i termini specifici quali la dimensione del frammento dell'obiettivo, la sequenza bassa del frammento amplificato ed il contenuto di GASCROMATOGRAFIA e la lunghezza dell'iniettore, compreso la temperatura, il tempo di estensione, ecc. di tempera.

Flusso di lavoro: